血清學檢查(參考件)

B1　血清學檢查有助于流行病學追溯診斷，檢查抗體的成分為抗菌抗體。為進行血清學診斷，需要采取病人的雙份血清，在發病第1～3天采第一份血清，第15～20天采第二份血清。檢查血清中抗菌抗體常用凝集試驗和殺弧菌試驗，殺弧菌試驗比凝集試驗敏感。

B2　試管凝集試驗：用生理鹽水對倍連續稀釋待檢血清，每管含稀釋血清0.5mL。將標準菌在營養瓊脂上的16～18h培養物用0.2％福爾馬林生理鹽水制成約含18億菌/mL(相當于細菌標準比濁管濃度)的懸液，每稀釋血清管加0.5mL；另將菌懸液加入0.5mL生理鹽水中作對照。搖勻，置37C3h觀察初步結果，再放冰箱

(4℃)或室溫過夜，觀察最后結果。生理鹽水對照不出現自然凝集，能使菌凝于管底成傘狀，上清半透明者判為＋＋，以能使菌呈＋＋凝集的血清最高稀釋度判為血清凝集效價。第二份血清效價比第一份血清增長4倍或以上者有診斷意義。

B3　殺弧菌抗體檢測：可采用改良微量法，檢測程序如下：

a.　2，3，5－氯化三苯四氮唑溶液(TTC)的配制：用無菌蒸餾水配制0.5％(W/V)溶液，加熱溶解，置滅菌棕色瓶中，4℃保存備用。

b.　補體指示菌混懸液制備：選取標準01群及0139群霍亂弧菌為指示菌，分別連續在營養瓊脂平板上分離2次，選取光滑型菌落2～3個，挑取小量接種于5mL營養肉湯中，37℃培養6h，取0.1mL轉種于5mL營養肉湯，37℃培養2h，用分光光度計測定492nm吸光度(OD)值，調整OD值至0.1為原液。將原液作1∶50稀釋后與1∶10補體等量混合，即為補體指示菌混懸液。

c.　待檢血清稀釋：于經洗滌處理、無水乙醇浸泡5min和紫外燈照射滅菌1h的微量培養板或4×10孔聚苯乙烯塑料板用微量加液滴管每孔加入一滴(0.025mL)滅菌磷酸鹽緩沖鹽水PBS或生理鹽水，再將待測滅活血清一滴(0.025mL)加入每排的第1孔，自第1孔開始作連續對倍稀釋至第10孔。

d.　加補體指示菌懸液：于每孔稀釋血清加入補體指示菌懸液一滴，加蓋，在微型振蕩器上振蕩1～2min，置37℃水浴箱孵育30min。

e.　加TTC營養肉湯：每孔加入含0.01％TTC的營養肉湯0.15mL(2大滴)，混勻后，繼續置37℃水浴箱孵育4h。

f.　觀察結果：以孔內無顏色變化的血清最高稀釋度為被檢測標本的殺弧菌抗體滴度，第二份血清效價比第一份血清升高8倍或以上者有診斷意義。